Idag utförde jag och min labbpartner en PCR reaktion och vi körde en elektrofores för att verifiera att vårt amplifierade templat är LL-37.
Resultatet av PCR var enligt följande bild :
Brunnen till vänster är plasmidpreparationen följt av, templatprovet,följt av negativ kontroll, följt av positiv kontroll, följt av markör 9 ,markör 3 samt ännu ett templatprov men som inte var spätt. Vid förberedning av templatmängden glömde vi späda plasmidpreparationen med den mängd vatten eller TE buffert vi skulle ha i ( 62 microliter + 1 microliter plasmid)
Vi kan konstatera att vi inte har någon LL-37 i vår negativa kontroll men att det skett en kontamination. Brunn två som var vårt templat innehåller LL-37 genen om man jämför den med den positiva kontrollen(känd LL-37genen). Brunn två har ett tjockt band som lyser starkt alltså har fragmentet vandrat och primers har bundit till DNA:t.
år negativa kontroll fick en så kallad ''smear'' och vi kan konstatera att en kontamination har skett.
Plasmidpreparatet visar två band och det påvisar att inget RNA fanns i preparatet eftersom det inte syns ett tredje band längst ner ( RNA vandrar snabbt och långt). I plasmidpreparatet så finns det ett band som lyser starkt och detta är plasmidens DNA i supercoil form. Vi har även fått ett ljusare band ( högre upp) men detta är DNA i open circle form. Detta åstadkoms pga. att DNA:t förlorat fosfodiester bindningar , detta kan vara för att det utsatts för en mekanisk påfrestning.
Som sagt innan så hade vi ett kontaminerat negativt prov, men trots detta kunde vi konstatera att vi har LL-37. Ifall att det skulle ha skett en carry over kontamination av LL-37 så skulle bandet av vårt templat vara så svagt som negativa kontrollen. Därför kunde vi dra en slutsats av det hela: Kontaminationen beror inte på fel arbetsteknik eller icke optimerat utförande. Något ämne har överförts från andra lösningar som redan var kontaminerat innan förberedelsen av PCR. Efter diskussion med andra grupper så kom vi fram till detta resultat eftersom de andra grupperna också hade fått en kontamination som liknade vår.
Vi kan även ta upp en annan felkälla och det är att vi vid Master Mix tillberedning använde vanligt dest.vatten istället för autoklaverat vatten. I kompendiet stod det inget om vad för vatten som skulle användas och därmed gjordes detta fel. Så vi kan tänka oss att något har följt med vattnet som fanns i bägaren. Eftersom under hela förberedningen så användes det filterspetsar som byttes ut vid varje pipetterings moment.
Trots vissa misstag så gick det väldigt bra , tack vare bra arbete med min labbpartner kunde vi tillsammans diskutera oss fram till våra misstag och försöka lösa problemen snabbt och smidigt.
En klyvning av plasmid gjordes fortsättning på detta blir vid nästa laborations tillfälle.
Vad jag tycker vore vara bra till nästa gång är att vi får en bättre förklaring om hur vi kan planera vår dag eftersom vissa moment kunde göras fast än momenten innan inte var färdiga.
Hej Jasmin!
SvaraRaderaFint gjort! Jag håller med dig att vissa moment ta längre tid speciellt med beräkningen. Jag förslår att få godkänd på alla beräkningen från läraren innan vi köra laboration.
Hälsning,
Noha F.
Det ser ut som ni lyckats bra med både er plasmidpreparation och PCR!
SvaraRaderaNi har en bra kvot och man ser inga andra nukleinsyror på elektroforesen.
En kvot på 1,9 säger dock inte att preparationen är ren. Det man kontrollerar här är framförallt om det finns proteiner kvar i preparationen, däremot kan man inte se om man har andra nukleinsyror kvar.
Med PCR har ni visat att ni har LL37 i plasmiden. Den smear som ni ser i den negativa kontrollen är däremot inte kontamination utan ospecifik amplifiering. Med kontamination menar man att man fått i DNA innehållande LL37 från någon annan källa än det templat man vill kontrollera. Man får då en specifik amplifiering av detta DNA (ett specifikt band på gelen) men sam sagt det kommer inte från det prov man vill kontrollera. Med ospecifik amplifiering så har primrarna bundit på fler ställen än det var tänkt och därmed givit amplifikat av olika längder (smear).
Meningen med att jag inte gick igenom hur ni skulle planera de olika momenten under labben var att ni skulle få övning i egen planering.
Hoppas det går lika bra med resten av laborationen.
Annica
Hej Jasmin! Det ser ut som om laborationen gått jättebra, men du pratar i slutet om en del misstag, du kan ju nämna dessa samt diskutera vad dessa misstag kan leda till, dessa misstag kan ju förändra ett resultat helt och hållet. Du pratar även om att du vill bli guidad i planeringen av din laboration men detta är individuell förberedelse som görs innan lab, om du gör ett mindre flödesschema för varje dag kanske det underlättare utförandet, bara ett tips! Du diskuterar dina resultat från elektroforesen bra och förklarar det som är mindre bra på ett mycket bra sätt!
SvaraRaderaMvh Anders J.
Hej Jasmin! Du nämner att flera i vår grupp hade någon sorts kontamination i den negativa kontrollen, men ni verkar ändå ha ett band (inte bara smear) i eran, som även verkar finnas i den positiva kontrollen, har du någon aning om vad det kan vara?
SvaraRaderaJag satt och funderade på samma sak som Caroline. Att det faktiskt ser ut som ett band längre ner i smearen... Fick ni någon kommentar om vad det kan vara av Annica eller Märit?
SvaraRaderaOm jag inte minns fel så skulle det vara någon ''översvämning'' från brunnarna. är dock osäker på om det jag skriver är rätt =)
SvaraRadera