Dag 4

Dagens laborations frågor:

Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?  

om vi jämför bilden av gelen från PCR-reaktionen med membranet från southern blottingen så kan vi dra slutsatsen att den största skillnaden var tydligheten av ll37 bilden. Vid PCR reaktionen hade vi ett band men detta syndes starkare på membranet.  Fördelen med att göra en PCR reaktion är att man sparar tid och flera analyser kan utföras samt att med endast små mängder av ett prov få en bra detektion. Men att den lätt kan ge falska svar pga att det är separata steg för amplifieringen vilket kan öka risken för kontamination.

Med hjälp av southern blot så bekräftade vi att vi har LL37 igen. Det starka bandet som syns i höger brunn är vår gen som hybridiserats med proben. Nackdelen med southern är väl att den tar tid och det är väldigt många steg man bör hålla koll på samt att det var för långa vänte tider, men medan man väntade så fanns det vissa lösningar som kunde förberedas vilket var positivt.

Det jag lärt mig från denna laboration är att planera min dag ,läsa kompendiet noggrant samt att arbeta självständigt och lita på mig själv även om man ibland kan göra misstag. gör man ett misstag så ska man bara gå tillbaka och lösa det =) sen är det bara att fortsätta med laborationen. Att använda mina praktiska kunskaper på labb är nog också en av de sakerna jag fått lära mig bättre dvs så som pipetterings teknik, namn påmaterial ,beräkning osv. 

Dag 2

Dag 2: PCR av plasmidprep  & Klyvning av plasmidprep

Idag utförde jag och min labbpartner en PCR reaktion och vi körde en elektrofores för att verifiera att vårt amplifierade templat är LL-37.

Resultatet av PCR var enligt följande bild :

Brunnen till vänster är plasmidpreparationen följt av, templatprovet,följt av negativ kontroll, följt av positiv kontroll, följt av markör 9 ,markör 3 samt ännu ett templatprov men som inte var spätt. Vid förberedning av templatmängden glömde vi späda plasmidpreparationen med den mängd vatten eller TE buffert vi skulle ha i ( 62 microliter + 1 microliter plasmid)

Vi kan konstatera att vi inte har någon LL-37 i vår negativa kontroll men att det skett en kontamination. Brunn två som var vårt templat innehåller LL-37 genen om man jämför den med den positiva kontrollen(känd LL-37genen). Brunn två har ett tjockt band som lyser starkt alltså har fragmentet vandrat och primers har bundit till DNA:t.

år negativa kontroll fick en så kallad ''smear'' och vi kan konstatera att en kontamination har skett. 

Plasmidpreparatet visar två band och det påvisar att inget RNA fanns i preparatet eftersom det inte syns ett tredje band längst ner ( RNA vandrar snabbt och långt). I plasmidpreparatet så finns det ett band som lyser starkt och detta är plasmidens DNA i supercoil form. Vi har även fått ett ljusare band ( högre upp) men detta är DNA i open circle form. Detta åstadkoms pga. att DNA:t förlorat fosfodiester bindningar , detta kan vara för att det utsatts för en mekanisk påfrestning.

Som sagt innan så hade vi ett kontaminerat negativt prov, men trots detta kunde vi konstatera att vi har LL-37. Ifall att det skulle ha skett en carry over kontamination av LL-37 så skulle bandet av vårt templat vara så svagt som negativa kontrollen.  Därför kunde vi dra en slutsats av det hela: Kontaminationen beror inte på fel arbetsteknik eller icke optimerat utförande. Något ämne har överförts från andra lösningar som redan var kontaminerat innan förberedelsen av PCR. Efter diskussion med andra grupper så kom vi fram till detta resultat eftersom de andra grupperna också hade fått en kontamination som liknade vår.

Vi kan även ta upp en annan felkälla och det är att vi vid Master Mix tillberedning använde vanligt dest.vatten istället för autoklaverat vatten. I kompendiet stod det inget om vad för vatten som skulle användas och därmed gjordes detta fel. Så vi kan tänka oss att något har följt med vattnet som fanns i bägaren. Eftersom under hela förberedningen så användes det filterspetsar som byttes ut vid varje pipetterings moment.

Trots vissa misstag så gick det väldigt bra , tack vare bra arbete med min labbpartner kunde vi tillsammans diskutera oss fram till våra misstag och försöka lösa problemen snabbt och smidigt.

En klyvning av plasmid gjordes fortsättning på detta blir vid nästa laborations tillfälle.

Vad jag tycker vore vara bra till nästa gång är att vi får en bättre förklaring om hur vi kan planera vår dag eftersom vissa moment kunde göras fast än momenten innan inte var färdiga. 

Dag1

Hej!

Idag genomfördes de första stegen av vår laboration. Laborationens syfte var att rena en rekombinant plasmid ( pBluscript) som skall innehålla en insert ( LL37 genen) från E.coli bakterier. Från en E-kolv med bakteriekultur pipetterades4,5ml av innehållet till ett eppendorfrör. Sedan tillsattes en buffert TE+RNase även kallad för P1 buffert. Det som skall ha skett vid tillsatts av denna buffert är att cellen lyserar och RNa skall ha klyvts , cellväggen lyseras och därmed det genomiska DNa't också eftersom det är förankrat i bakteriers cellvägg. En tillsats av P2 buffert ( NaOH + SDS) denaturerar DNA och SDS tar bort cellmembranet, detta gör att cellens innehåll läcker ut.. För att det genomiska DNA't ska bli en del av celldebris tillsätts P3 buffert ( acetatbuffert) detta leder till en fällning av det genomiska DNA't. Efter tillsattsen av dessa buffertar så centrifugerades röret och det bildades en kraftig pellet som innehöll följande molekyler:

• Kromosomalt DNA,Proteiner samt celldebris.

Supernatanten: 

• Plasmid DNA ,rester av proteiner som är för små för att centrifugeras  

vid tillsatts av de olika buffertarna så förlorade alla molekyler sin ursprungliga form det skedde alltså en konformationsförändring, men eftersom Plasmider har CCC '' closed covalently circular'' struktur  så får de tillbaka sin form efter neutralisering.

Nästa steg var att överföra supernatanten till ett glasfiberkolonn. I kolonnen finns ett membran som plasmid DNA samt RNA binder till . I membranet finns ett chaotropiskt salt som gör att DNA't och RNA't binder. RNA kommer inte binda lika hårt till membranet så som DNA't gör eftersom RNA inte har lika mycket negativa laddningar . Membranet tvättas med en EB buffert som tvättar bort RNA och proteiner.  Efter detta steg har man troligvis fått rent DNA, ännu kan det inte sägas om det endast är rent DNA. För att detektera detta görs en absorbansmätning med hjälp av en spektrofotometer.

Vid spektrofotometern  avläses absorbansen  vid 260nm samt 280nm . En Blank ( TEbuffert) används för att nollställa och sedan tillsätts DNA-prepp. som späds 100 gånger ( 1 +99). Vid överföring från röret till kyvetten kan det vara svårt att få med all lösning, därför är det bra att överföra den spädda lösningen med en pipett till kyvetten. Vid genomförandet avd etta så hällde vi över lösningen direkt utana tt använde någon pipett och avläste absrobansvärdet A260 = 0,065 och A280=0,033. men för att vara säkra att vi inte fått fel värden så gjorde vi ett till försök där vi istället använde en pipett vid överföringen och resultat blev följande :
A260=0,063 , A280=0,033. Alltså så var det ingen stor skillnad och det påverkade inte vårt resultat.

Kvoten av absorbansvärdet avgör delvis om vi har föroreningar i lösningen eller inte. Vid ''ren'' lösning ska kvoten ligga mellan 1,6 och 2,0 . Resultatet för oss blev 1,9 vilket är bra. En slutsats som vi unde dra var att vi inte hade föroreningar i lösningen, ännu kan detta inte vara 100% säkert men förhoppningsvis så är det så.

En koncentrations bestämning skedde och det gjordes på följande sätt:

1 absorbansenhet vid 260 nm motsvarar 50 ug DNA/ml
50ug/ul /100*0,065A*100=0,315ug/ul

 bild1. Visar absorbansen av vår lösning 

Nu har ni fått läsa vad jag och min medlaborant gjort under vår första laborationsdag. Några dagar till och ni får läsa om den fantastiska resan genom labbet igen. 

Ha det bra!

 

 

Hej!

Hej!

Denna blogg är gjord för att ni under fyra dagar ska få en översiktlig bild av min laboration samt mina reflektioner över den

/ Jasmin