Idag genomfördes de första stegen av vår laboration. Laborationens syfte var att rena en rekombinant plasmid ( pBluscript) som skall innehålla en insert ( LL37 genen) från E.coli bakterier. Från en E-kolv med bakteriekultur pipetterades4,5ml av innehållet till ett eppendorfrör. Sedan tillsattes en buffert TE+RNase även kallad för P1 buffert. Det som skall ha skett vid tillsatts av denna buffert är att cellen lyserar och RNa skall ha klyvts , cellväggen lyseras och därmed det genomiska DNa't också eftersom det är förankrat i bakteriers cellvägg. En tillsats av P2 buffert ( NaOH + SDS) denaturerar DNA och SDS tar bort cellmembranet, detta gör att cellens innehåll läcker ut.. För att det genomiska DNA't ska bli en del av celldebris tillsätts P3 buffert ( acetatbuffert) detta leder till en fällning av det genomiska DNA't. Efter tillsattsen av dessa buffertar så centrifugerades röret och det bildades en kraftig pellet som innehöll följande molekyler:
- Kromosomalt DNA,Proteiner samt celldebris.
Supernatanten:
- Plasmid DNA ,rester av proteiner som är för små för att centrifugeras
vid tillsatts av de olika buffertarna så förlorade alla molekyler sin ursprungliga form det skedde alltså en konformationsförändring, men eftersom Plasmider har CCC '' closed covalently circular'' struktur så får de tillbaka sin form efter neutralisering.
Nästa steg var att överföra supernatanten till ett glasfiberkolonn. I kolonnen finns ett membran som plasmid DNA samt RNA binder till . I membranet finns ett chaotropiskt salt som gör att DNA't och RNA't binder. RNA kommer inte binda lika hårt till membranet så som DNA't gör eftersom RNA inte har lika mycket negativa laddningar . Membranet tvättas med en EB buffert som tvättar bort RNA och proteiner. Efter detta steg har man troligvis fått rent DNA, ännu kan det inte sägas om det endast är rent DNA. För att detektera detta görs en absorbansmätning med hjälp av en spektrofotometer.
Vid spektrofotometern avläses absorbansen vid 260nm samt 280nm . En Blank ( TEbuffert) används för att nollställa och sedan tillsätts DNA-prepp. som späds 100 gånger ( 1 +99). Vid överföring från röret till kyvetten kan det vara svårt att få med all lösning, därför är det bra att överföra den spädda lösningen med en pipett till kyvetten. Vid genomförandet avd etta så hällde vi över lösningen direkt utana tt använde någon pipett och avläste absrobansvärdet A260 = 0,065 och A280=0,033. men för att vara säkra att vi inte fått fel värden så gjorde vi ett till försök där vi istället använde en pipett vid överföringen och resultat blev följande :
A260=0,063 , A280=0,033. Alltså så var det ingen stor skillnad och det påverkade inte vårt resultat.
Kvoten av absorbansvärdet avgör delvis om vi har föroreningar i lösningen eller inte. Vid ''ren'' lösning ska kvoten ligga mellan 1,6 och 2,0 . Resultatet för oss blev 1,9 vilket är bra. En slutsats som vi unde dra var att vi inte hade föroreningar i lösningen, ännu kan detta inte vara 100% säkert men förhoppningsvis så är det så.
En koncentrations bestämning skedde och det gjordes på följande sätt:
1 absorbansenhet vid 260 nm motsvarar 50 ug DNA/ml
50ug/ul /100*0,065A*100=0,315ug/ul
Inga kommentarer:
Skicka en kommentar